qPCR-Mastermixe enthalten DNA-bindende Farbstoffe, die auch Histologen gut gebrauchen können.
Foto: Asolina Braun
Der nachfolgende Trick kam vor einiger Zeit zustande, als meine Kollegin Lyudmila Kostenko und ich beim Kaffee unsere Frustrationen über die Fluoreszenzmikroskopie austauschten.
Einige Organe zeigen eine hohe Autofluoreszenz bei der Anregungswellenlänge von 488 Nanometer, die in der Fluoreszenzmikroskopie häufig eingesetzt wird (A.488 Kanal). Das ist sehr ärgerlich, da der verwendete fluoreszenzmarkierte Antikörper in diesem Kanal entsprechend stark leuchten muss, um sich vom Hintergrund abzuheben.
Eines Nachmittags grübelten wir darüber nach, wie wir das Problem umgehen könnten. Mit Ausbleichmethoden hatten weder Lyudmilla noch ich Erfahrung. Das kommt ohnehin nicht in Frage, wenn man Fluoreszenzproteine wie mCherry im Präparat visualisieren möchte. Unser nächster Gedanke war, den A.488 Kanal zu benutzen, um nukleäre Membranproteine zu färben und dadurch den DAPI-Kanal (360 nm) für andere Antikörper freizumachen. Wir wollten jedoch für einen entsprechenden Test nicht noch mehr teure Antikörper kaufen.
Da hatten wir einen Aha-Moment: SybrGreen bindet und färbt DNA und ist obendrein in so gut wie jedem Labor vorhanden das qPCRs durchführt! Also zweckentfremdete ich am nächsten Tag einen qPCR-Mastermix, um die Zellkerne zu färben, was auch wunderbar funktionierte. Allerdings darf der Mastermix keinen Referenzfarbstoff, wie zum Beispiel ROX, enthalten.
Möchte man die Ergebnisse publizieren, empfiehlt es sich, nach den Vorversuchen reines SybrGreen einzusetzen. Alternativ kann man auch EvaGreen verwenden (siehe Bild). Auch andere DNA-Farbstoffe wie zum Beispiel SYTO-Farbstoffe oder GelGreen sollten funktionieren. Das müsste man jedoch im Einzelnen testen.
Mit diesem Trick färben wir günstig und schnell Zellkerne im A.488 Kanal. Mit der starken Färbung des Nukleus überwindet man die Autofluoreszenz und hat den DAPI-Kanal frei für fluoreszierende Antikörper – ohne störende Autofluoreszenz.
Asolina Braun
(Asolina Braun ist Post-Doc in Fabienne Mackays Gruppe am Peter Doherty Institut der Universität Melbourne, Australien)