Die einzelnen Schritte von DipGene sind supersimpel, und schnell durchzuführen. Foto: iGEM-Team Dresden
(09.02.2020) Das Dresdner iGEM-Team entwickelte eine Nachweismethode für spezifische Gensequenzen, die so einfach ist wie die Bestimmung des pH-Werts einer Lösung mit einem Teststreifen. Und das Beste daran: Für den DNA-Test braucht man nicht viel mehr als einen Papierstreifen und ein frisiertes dCas9-Protein.
Bei der von neun Studenten aus dem Biotechnologischen Zentrum der TU Dresden entwickelten Nachweistechnik wird die zu untersuchende DNA zunächst auf einem Papierstreifen immobilisiert. Anschließend dippt man diesen in eine Lösung, die sich blau färbt, wenn das anvisierte Zielgen in der Probe vorhanden ist. Die Gruppe nennt ihr Verfahren deshalb DipGene (https://2019.igem.org/Team:TU_Dresden).
DipGene ist eine sehr smarte Kombination aus zwei klassischen molekularbiologischen beziehungsweise biochemischen Techniken mit der synthetischen Biologie. Die DNA wird zunächst mit der von Jimmy Botellas Gruppe entwickelten Papierextraktion aus dem Zelllysat isoliert und auf einem Papierstreifen gebunden (PLoS Biol. 15(11): e2003916; Laborjournal Editorial 10.1.2018).
Nach einem Waschschritt wird der Papierstreifen in eine Lösung getaucht, die ein spezielles dead(d)Cas9-Fusionsprotein enthält, das die Dresdner iGEM-Gruppe in Eigenregie geklont, exprimiert und gereinigt hat. Da die synthetische Biologie beim iGEM-Wettbewerb im Vordergrund steht, ließen die Dresdner auch diese in ihre Arbeit einfließen. Sie nutzten sie, um mithilfe von sogenannten BioBricks ein Fusionskonstrukt herzustellen, das aus dCas9 sowie der Meerrettich-Peroxidase (HRP) besteht.
dCas9 wird zwar wie Cas9 von einer guideRNA (gRNA) zur Zielsequenz geleitet, kann diese aber nicht schneiden, weil sie durch eine Mutation ihre Endonuklease-Aktivität verloren hat.
Die auf dem Papier immobilisierte DNA wird in eine Lösung mit der dCas9-HRP-Fusion eingetaucht. dCas9-HRP bindet mithilfe der gRNA nur an DNA mit passender Ziel-Sequenz. Anschließend überführt man den Papierstreifen in eine Lösung mit einem HRP-Substrat. Hat das Fusionsprotein an eine spezifische DNA-Sequenz angedockt, wird es mit dieser in die Substrat-Lösung transferiert und HRP katalysiert eine blaue Farbreaktion. Wird es nicht gebunden, bleibt die Lösung farblos.
Der Farbumschlag tritt nur auf, wenn eine DNA-Sequenz in der untersuchten Probe komplementär zur eingesetzten gRNA ist. Man muss also nur die gRNA austauschen, um mit DipGene nach einem gewünschten Zielgen zu suchen. Ob DipGene sensitiv genug ist, um auch Punktmutationen zu erkennen, muss erst noch untersucht werden. Es sollte aber auf jeden Fall mit der Technik möglich sein, Viren nachzuweisen, die sich in das menschliche Genom integrieren, wie etwa HIV. Ebenso könnte man mit DipGene Proben auf genetische Erkrankungen, Parasiten oder bakterielle Infektionen testen.
DipGene benötigt weder spezielles Laborequipment noch Elektrizität und kann auch von Laien durchgeführt werden. Die Methode könnte deshalb genetische Tests auch in Regionen der Welt ermöglichen, die nur über beschränkte labortechnische Ressourcen verfügen. In größeren Mengen produziert, sollte auch der Preis der dCas9-HRP-Fusion keine zusätzliche Hürde für den Zugang zu sequenzspezifischen DNA-Tests sein.
DipGene erleichtert aber auch Routinearbeiten von Biowissenschaftlern, etwa beim Klonieren. Statt mehr als zwei Stunden mit DNA-Extraktion, PCR und anschließender Gelelektrophorese auf der Suche nach positiven Klonen zu verbringen, weist man die Klone mit DipGene nach und verkürzt dadurch die Zeit auf zehn Minuten. Ganz nebenbei sinken hierdurch auch die Materialkosten erheblich. Und auch bei Feldforschungen in abgelegenen Gebieten könnte DipGene eine wertvolle Hilfe sein.
Mara Müller
(iGEM-Team Dresden)