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Tipp 36:
Standardisierungs-Check bei Immunpräzipitation (IP)
Optimal gleichmäßig?

...das ist die große Frage, will man bei Immunpräzipitations-Assays viele parallel verarbeitete Proben miteinander vergleichen. MTA Claus Mayer (Sektion f. Strahlenbiologie und Molekul. Umweltforschung, Uniklinikum Tübingen) weiss Rat:


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"Immer wieder taucht folgende Frage auf: "Wie gleichmäßig war die Immunpräzipitation (IP)?" Wir untersuchen in unserem Labor u. a. die Phosphorylierung bestimmter Proteine. Dazu werden die Proteine (z. B. der EGFR) mittels spezifischer Antikörper immunpräzipitiert, um die Proteine für Kinaseassays (radioaktiv!) anzureichern. Wenn man diese IP mit sehr vielen Proben durchführt, kommt es durchaus vor, dass man beim Waschen des Immunpräzipitats ungleichmäßig absaugt und somit unterschiedliche Mengen des gewünschten Proteins für den Assay einsetzt.

Das kann man ganz leicht nachweisen, indem man zum obigen Ansatz einfach noch einen Aktin-Antikörper einsetzt und somit Aktin als stabil exprimiertes Protein ("housekeeping-Protein") detektiert; beispielsweise nach dem Blotten des Gels auf Nitrozellulose.

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Für den Fall, daß man die Radioaktivität über Audioradiographie nachweist, wird das Gel, bevor es getrocknet wird, mit Coomassie R(!) gefärbt und danach mit Entfärbelösung entfärbt. So kann man ganz leicht die Menge an Aktin als auch die Menge an eingesetztem Antikörper nachweisen."


Coomassie Blau Färbelösung
50 % (v/v) Methanol
10 % (v/v) Essigsäure (100 %)
0,25 % (v/v) Coomassie Blue R-250

Entfärbelösung
10 % (v/v) Methanol
5 % (v/v) Essigsäure (100 %)
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Letzte Änderungen: 08.09.2004


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