Tipp 71:
Mit hoher Ausbeute: Verdaute DNA-Fragmente isolieren

Ziemlich zu kämpfen hatte Gabriele Hollatz (Institut für Biomedizinische Forschung, Uni Frankfurt) zu Beginn ihrer Doktorarbeit, als sie versuchte, restriktionsverdaute DNA-Fragmente über ein Agarosegel aufzutrennen:

"Zur Herstellung eines neuen Plasmidkonstrukts werden meist vorhandene Plasmide mit Restriktionsenzymen verdaut und die gewünschten Fragmente isoliert. Dann erfolgt eine passende Ligation einzelner Fragmente bzw. eines Backbones mit ein oder zwei Inserts. Für eine Ligationsreaktion sollten die Fragmente möglichst rein sein, d.h. frei von Salzen und Proteinen.

Mir wurde zu Beginn meiner Doktorarbeit folgende Methode zur Isolierung von DNA-Fragmenten gezeigt: Zunächst sei der Verdau durchzuführen, um dann das fragment of interest über ein Agaraose-Gel aufzutrennen. Das Fragment wird aus dem Gel mit Hilfe eines Skalpells herausgeschnitten und dann aus dem Gel extrahiert (z.B. mittels einer kleinen Säule). Zur Reinigung schließt sich noch eine Phenol/Chloroform-Extraktion an.

Mit diesem Protokoll war die Auftrennung über das Gel sehr unsauber: Die Fragmente bildeten eher einen Schmier statt einer schönen und feinen, klar abzugrenzenden Linie. Wenn ich diesen Schmier dennoch ausschnitt und eine Phenol/Chloroformextraktion durchführte, war die Ausbeute sehr gering, in einigen Fällen sogar gleich null.

Frustriert vertauschte ich die Schritte Gel- bzw. Phenol/Chloroform-Extraktion. So führte ich direkt nach dem Verdau die Phenol/Chloroform-Extraktion durch und trennte dann die Fragmente über ein Gel auf. Der proteinfreie Verdau ließ sich viel besser auftrennen: Alle Gele zeigten klare schmale Linien, so dass die Fragmente sehr eindeutig über ihre Größe identifiziert und entsprechend auch präziser extrahiert werden konnten. Nicht zuletzt ließ sich hierdurch auch das Problem der geringen Ausbeute beheben: Die Ausbeute stieg von 0-10 ng auf 50-500 ng!

Offensichtlich stellen die Proteine ein Hindernis dar, um DNA-Fragmente sauber über ein Agarose-Gel aufzutrennen."



Letzte Änderungen: 08.02.2005