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Altersnachweis für Zellen

(12.10.16) Der Zahn der Zeit nagt an jedem lebenden Organismus und seinen Bestandteilen. Zellalterung (zelluläre Seneszenz) ist ein unumkehrbarer, langsam fortschreitender Prozess, der mit einer Vielzahl von Krankheitsbildern einhergeht. Der griechische Krebsforscher Vassilis Gourgoulis entwickelte zusammen mit Kollegen aus Spanien, England, Dänemark und Schweden eine einfache Seneszenz-Färbung, mit der sich alternde Zellen zuverlässig aufspüren lassen.  

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© Ageing and Stress Group, University of Namur, Belgium

Auslöser der zellulären Seneszenz ist einerseits die molekulare Uhr: Die Telomere werden sukzessive kürzer und setzen ein endgültiges Stop-Signal. Andererseits kann die Zellalterung auch durch Stress ausgelöst werden. In gutartigen Tumoren und Vorstufen bösartiger Tumore kommen alternde Zellen gehäuft vor.

Alternde Zellen teilen sich nicht mehr, ihr Stoffwechsel bleibt aber auf Touren. Die Zellen verraten sich durch die Seneszenz-assozierte ß-Galaktosidase (SA-ß-Gal), die erst im Alter erwacht. Seneszenzforscher setzen daher meist bei diesem Enzym an und weisen SA-ß-Gal mit histochemischen Methoden in Gewebsschnitten, etwa von Maus und Mensch, aber auch in Zellkulturen nach. Diese messen jedoch das aktive Enzym. In archivierten Zellen, etwa in formalinfixierten Gewebeschnitten, funktioniert der SA-ß-Gal Nachweis nicht.

Das Team um Gourgoulis konzentriert sich deshalb schon seit einiger Zeit auf einen weiteren Seneszenz-Marker, der sich auch für die Seneszenz-Färbung in archivierten Zellen eignet: Lipofuscin.

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Lipofuscin ist eine Ansammlung aus oxidierten Proteinen, Fetten und Metallen, die sich in den Lysosomen alter Gewebe anreichern. Schon 2013 stellten Gourgoulis' Mitarbeiter fest, dass der lipophile Farbstoff Sudan-Black-B (SBB) an die Fettkomponenten von Lipofuscin bindet (AGING, 1, 37-50). Nach der SBB-Färbung erscheinen die Aggregate („Age Pigments“) unter dem Mikroskop als schwarze Pünktchen.

Das Problem dieser Färbung ist jedoch, dass nur routinierte Pathologen die winzigen schwarzen Körner unter dem Lichtmikroskop erkennen und von "Schmutzpartikeln" unterscheiden können. Gourgoulis und Co. untersuchten kommerzielles SBB von verschiedenen Herstellern mittels HPLC sowie NMR und fanden in sämtlichen Chargen Spuren von Synthese-Rückständen. Da diese nicht alle farblos sind, können sie zu irreführenden Senezenz-Färbungen führen.

Das Forscherteam ließ sich hiervon jedoch nicht beirren und synthetisierte kurzerhand eigene SBB-Analoga ohne störende Verunreinigungen, die sie mit einem weiteren Trick für die Lipofuscin-Färbung optimierten: die Forscher koppelten die synthetisierten Substanzen an Biotin (Evangelou et al., Ageing Cell, in press). Hierbei achtete Gorgoulis' Gruppe penibel darauf, die Strepatividin-Bindestelle des Biotin-Moleküls nicht zu blockieren.

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Mit den Biotin-gekoppelten SBB-Analoga färbten Evangelou et al. Gewebsschnitte sowie Zellen und verglich die Ergebnisse mit der SBB-Färbung. Eines der synthetisierten Derivate mit dem unspektakulären Namen „GL13“ (www.gorgoulis.gr/research-activity/main-topics), lieferte vergleichbare Seneszenz-Färbesignale wie SBB, die jedoch nicht durch Synthese-Rückstände gestört wurden.

Nach der Färbung mit GL13 inkubierten die Wissenschaftler die Zellkulturen und Gewebeproben mit anti-Biotin-Antikörpern, die an einen Peroxidase-Substrat (DAB)-Komplex gekoppelt waren. Bei diesem Histo-Immunochemischen Hybrid-Assay fällt das von der Peroxidase-umgesetzte DAB aus und ist als braunes Präzipitat erkennbar. Laut Evangelou et al., verbessert dieser zusätzliche Detektions-Schritt die Sensitivität der Seneszenz-Färbung dramatisch

Die neue Färbemethode eignet sich für in vitro und in vivo Analysen, für frische, gefrorene und konservierte Zellkulturen sowie Gewebeschnitte. Zudem ist sie kompatibel mit Durchflusszytometrie und Immunofluoreszenz-Analysen.

Wer GL13 "nachkochen" will, findet das ausführliche Synthese-Protokoll in den Supplements zu Gourgoulis' Paper.

Andrea Pitzschke

 

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Letzte Änderungen: 02.11.2016

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