(08.03.2021) Anne Diehl und Nils Cremer vom Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (FMP) in Berlin entwarfen ein Protokoll, mit dem man die Resistenz-Kassette in Plasmiden im Nu wechseln kann.
Die Co-Transformation von zwei Plasmiden in eine E.-coli-Zelle kann aus verschiedenen Gründen nötig sein. Doch was passiert, wenn beide Plasmide den gleichen Selektionsmarker beherbergen? Dann verzichtet man möglicherweise auf ein Experiment, weil man den Plasmid-Umbau scheut. Mit unserer Methode lässt sich dies jedoch sehr einfach und flott bewerkstelligen (bioRxiv, doi: 10.1101/2021.01.28.428618).
Der wichtigste Schritt ist das Primer-Design, für das ein bisschen Bioinformatik nötig ist. Die flankierenden Sequenz-Abschnitte der auszutauschenden Antibiotika-Resistenz-Kassetten (ARCs) werden mittels Alignment in beiden Richtungen verglichen. Dabei muss man beachten, dass Kanamycin- und Ampicillin-Kassetten meist in unterschiedlichen Richtungen in Plasmide eingebaut sind.
Da viele Plasmide von wenigen Urtypen abstammen, findet man häufig identische Abschnitte, die man für Primer nutzen kann, die vor beziehungsweise hinter der ARC von Spender- und Empfänger-Plasmid hybridisieren sollen. Hierbei muss man darauf achten, dass die Primersequenzen außerhalb von regulatorischen Einheiten liegen, da diese in der PCR mit vervielfältigt werden müssen.
Für unseren 56 Basen langen Vorwärts-Primer fanden wir auf beiden Plasmiden vollständig identische Abschnitte. Beim 55 Basenpaare langen Rückwärts-Primer passten 39 zur anvisierten Sequenz auf dem Spender-Plasmid und 55 zur Sequenz auf dem Ziel-Plasmid. Wir haben uns für diese langen Primer entschieden, weil in den ersten Runden der zweiten PCR auf die 55 Basen, die paaren können, circa 1.000 Basen der einzubauenden ARC folgen, die zunächst frei beweglich sind. Das Primer-Design ist der kritische Punkt. Passen die Primer, ist die Methode außerordentlich robust und hat bei uns auf Anhieb funktioniert.
Für die erste PCR wird das Spender-Plasmid mit der gewünschten Antibiotika-Resistenz benötigt. Die ARC des Spender-Plasmids wird mit den beiden Primern und einer Proofreading-Polymerase vervielfältigt, etwa mit der KOD-Polymerase. Dabei entsteht ein PCR-Produkt, dessen zwei 3‘-Enden komplementär zur Umgebung der ARC des Zielplasmids sind.
In der zweiten PCR wird das gesamte Ziel-Plasmid mit Ausnahme der ursprünglichen ARC vervielfältigt. Als Primer verwendet man das gereinigte PCR-Produkt aus der ersten PCR. Für die zweite PCR sollte man etwas mehr Elongationszeit einplanen und ebenfalls eine Proofreading-DNA-Polymerase einsetzen. Anschließend wird das als Template genutzte Ziel-Plasmid mit DpnI verdaut. Nach Hitze-Inaktivierung wird der Ansatz schließlich in einen kompetenten E.-coli-Klonierungs-Stamm transformiert, etwa DH5α. Auf einer Selektionsplatte mit Kanamycin erscheinen nur Transformanten mit dem umgebauten Plasmid. Unser Protokoll ist Ligations-unabhängig – die Ligation übernimmt E. coli.
Am nächsten Tag kann die Kultur für die Plasmid-Präparation der Transformanten angesetzt werden. Sicherheitshalber kann man das Plasmid sequenzieren oder den Umbau des Plasmids mit einem Restriktionsverdau nachweisen. Danach steht der Co-Transformation nichts mehr im Weg. Viel Erfolg!
Nils Cremer & Anne Diehl