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Elektrooptische
Membran-Analyse

(25.05.2022) Membranforscher können ihre Proben elektro­physiologisch untersuchen – oder visuell per Mikroskop. Der MECA-Opto-Chip kann beides gleichzeitig.
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Der MECA-Opto-Chip schematisch und „in real life“

Physiologen beschäftigen sich häufig mit der Charak­terisierung biologischer Membran­systeme. Sie interessieren sich dabei insbesondere für die physiko­chemischen Eigenschaften der Membranen und der darin integrierten Proteine. Neben klassischen elektro­physiologischen Methoden verwenden Membran­forscher für ihre Untersuchungen zunehmend auch hochauflösende Varianten der Fluoreszenz­mikroskopie. Die Elektro­physiologie ermöglicht eine gezielte Stimulation des Membran­systems durch Veränderung des Transmembran­potentials und erlaubt hierdurch präzise Messungen der Leitfähigkeit und Kapazität der gesamten Membran (Voltage-clamp). Mit den optischen Methoden kann der Experimentator das System ortsaufgelöst beobachten – eine einfache In-situ-Stimulation ist mit ihnen aber per se nicht möglich.

Unsere Arbeitsgruppe Membran­physiologie und -Technologie am Physiologischen Institut der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg hat ein Chip-basiertes System entwickelt, mit dem man eine Membran elektro­physiologisch untersuchen und gleichzeitig optisch analysieren kann. Die Kombination beider Methoden liefert neue Einblicke in die Struktur-Funktions­dynamik von Membran­systemen.

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Aufgespannte Membran

Herzstück der Versuchs­anordnung ist der MECA-Opto-Chip, der vom Freiburger Start-up Ionera Technologies produziert wird. MECA steht für Micro-Cavity-Electrode-Array. Der Chip enthält vier kreisförmige Vertiefungen (Mikrokavitäten), die mithilfe von Dünnschicht-Techniken (Lithographie) in ein Glassubstrat mit hoher optischer Güte eingearbeitet werden. Jede Kavität ist zwanzig Mikrometer tief und definiert eine Apertur von 150 Mikrometern Durchmesser. Über den vier Aperturen kann jeweils eine einzelne, frei stehende Bilipidschicht aufgespannt werden, wodurch vier unabhängige cis-Kompartimente sowie ein gemeinsames trans-Kompartiment entstehen. Um die Kosten gering zu halten, und dennoch ein gutes Handling zu gewährleisten, ist das Glassubstrat in die Struktur eines gedruckten Schaltkreises (PCB) integriert, der den eigentlichen Chip bildet.

Für die elektrophysi­ologische Charakterisierung beziehungsweise Stimulierung ist ein elektrischer Spannungs­gradient über der Lipiddoppel­schicht notwendig. Im MECA-Opto-Chip wird das Spannungs­gefälle mit Mikroelektroden erzeugt, die in Ring- oder Hufeisenform auf dem Boden der Kavitäten angeordnet sind. Sie werden gegen eine gemeinsame große Ringelektrode auf der trans-Seite, die in ein Flüssigkeits­reservoir über dem Glassubstrat eintaucht, betrieben. Die Elektroden lassen sich mit Messverstärkern, etwa dem ORBITmini von Nanion Technologies, ansteuern beziehungsweise auslesen. Die Versuchs­anordnung ist quasi ein elektrophysio­logisches Labor im Hosentaschen­format, das auf den meisten Mikroskopen Platz findet.

Das MECA-Opto-System zielt aber nicht darauf ab, alle Membranen in den vier Kavitäten gleichzeitig optisch-elektrisch zu analysieren. Die vier Kavitäten sollen vielmehr die Erfolgsrate der Experimente erhöhen. Die Chance, eine elektrisch stabile Membran mit einem eingebauten Fluoreszenz-markierten Protein oder einem Peptid in der gewünschten Dichte zu finden, ist in dem vierfachen Ansatz größer als bei einer einzelnen Membran. Und sollte zum Beispiel eine Membran reißen, kann man den ORBITmini auf dem Mikroskoptisch verschieben und das Experiment ohne großen Aufwand mit der nächsten Kavität fortsetzen oder neu beginnen.

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Robustes System

In konventionellen Systemen sind die frei stehenden Bilipid­schichten von Membranen sehr fragil und lassen sich kaum unter dem Mikroskop beobachten. Mit dem MECA-Opto-Chip ist dies jedoch möglich. Die Chipoberfläche wird von dem wässrigen Elektrolyten zum einen gut benetzt. Sie interagiert aber gleichzeitig auch sehr stark mit den hydrophoben Molekülen der Bilipidschicht und stabilisiert hierdurch die künstliche Membran. Die mit 150 Mikrometern Durchmesser relativ großen Membranen sind so robust, dass man das gesamte System problemlos über mehrere Meter transportieren kann, ohne die frei stehende Bilipidschicht zu beschädigen. Gleichzeitig gewährleisten die Ring- beziehungsweise Hufeisen­elektroden die Transmission der Lichtstrahlen durch die Membranen.

Wir verwendeten den MECA-Opto-Chip auf einem konfokalen Mikroskop mit hoher numerischer Apertur, um Diphytanoyl-sn-glycero-phosphocholin (DPhPC)-Membranen zu charakterisieren, die mit einer fluoreszierenden Lissamin-Rhodamin-Phosphatidyl­ethanolamin-Lösung gelabelt waren.

Gekrümmt statt planar

Mithilfe einer angelegten Dreieck­spannung bestimmten wir kontinuierlich die Kapazität der Membran und damit auch ihre Dicke. Bisher ging man davon aus, dass derartige Membranen vollständig planar sind. Wir beobachteten jedoch, dass sie deutliche Kurvaturen aufweisen können. Die Kurvatur einer Membran und damit ihre effektive Fläche hat einen direkten Einfluss auf die Einbaukinetik von Membran­proteinen beziehungsweise von Membran-aktiven Peptiden.

Zudem untersuchten wir mit dem DPhPC-Membran-System ein Fluoreszenz-markiertes Ceratotoxin-A-Peptid, das unter elektrischer Spannung transiente Poren ausbildet. In der Natur schützt das antibakterielle Peptid die Eier weiblicher Mittelmeer­fruchtfliegen (Ceratitis capitata). Es ist aber auch ein wichtiger Wirkstoff-Kandidat für die Tumor­behandlung und wird im Kampf gegen multiresistente Pathogene eingesetzt. Für die Wirkstoff-Forschung ist es aber zwingend notwendig, den genauen Insertions­mechanismus zu kennen.

Regulierte Porenbildung

Um die dynamische Ausbildung transienter Toxin-Poren verfolgen zu können, kombinierten wir zwei orthogonal polarisierte Einzelphotonen-Detektoren mit der hochauflösenden Elektrophysiologie. Anhand der auftretenden Fluoreszenz-Anisotropie beobachteten wir, dass zwar sehr viele Moleküle des Peptids an der Membran anhaften, jedoch nur ein geringer Anteil dazu tendiert, Poren zu bilden. Für den erfolgreichen Einbau von Ceratotoxin-A in eine DPhPC-haltige Membran ist also eine sehr hohe Konzentration des Toxins notwendig. Im biologischen System könnte dies bedeuten, dass die Porenbildungs-Aktivität von Ceratotoxin-A vom Typ der Membran abhängt. Möglicherweise schützt dies die Mittelmeer­fruchtfliege vor der Selbstintoxikation.

Tobias Ensslen

Ensslen T. & Behrends J. (2022): A chip-based array for high-resolution fluorescence characterization of free-standing horizontal lipid membranes under voltage clamp. BioRxiv, DOI: 10.1101/2022.04.18.488685

Bild: Ensslen et al.




Letzte Änderungen: 25.05.2022