Die Präparation von Plasmid-DNA (pDNA) aus Bakterien mit der gängigen alkalischen Lyse ist nicht besonders aufregend und die Handgriffe sind überschaubar: Zellen pelletieren, die im Plasmid-Prep-Kit enthaltenen Puffer zugeben, hier und da ein bisschen vortexen, sanft schwenken, zentrifugieren und dann resuspendieren. Routinierte Experimentatoren erzielen mit den üblichen Protokollen und Kits zumeist gute und reproduzierte Plasmid-Ausbeuten – mit Gram-negativen Bakterien wie E. coli. Mit Gram-positiven Bakterien wie zum Beispiel Lactobacillus plantarum oder Staphylococcus aureaus sieht die Sache aber etwas anders aus. Prinzipiell funktioniert auch bei diesen die klassische alkalische Lyse, doch um an die pDNA im Inneren der Zelle heranzukommen, muss man zunächst die Zellwand knacken. Dazu kann man die Zellen mit Glaskügelchen versetzen und dann mechanisch auf dem Vortexer malträtieren oder alternativ mit Enzymen wie Lysozym behandeln, die die Zellwand zerlegen.
Unschöne Präzipitate
Lysozym hydrolysiert 1,4-beta-Verknüpfungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglucosamin. Höhere Lysozym-Konzentrationen steigern zwar die Effizienz der Lyse und versprechen höhere Plasmid-Ausbeuten. Überschüssiges Lysozym bildet jedoch unschöne Präzipitate mit der pDNA, die die Ausbeute schmälern. Idealerweise sollten die Bakterienwände abgebaut werden, ohne die Zellen aufzubrechen. Dazu muss man das Lysozym von den noch intakten nackten Zellen entfernen, bevor es mit der alkalischen Lyse-Technik nach Schema F weitergeht. Qu Pans Gruppe am Chengdu Medical College in China entwickelte vor vier Jahren ein einfaches Protokoll, mit dem sich Lysozym nach der Lyse der Zellwand durch einen Zentrifugationsschritt entfernen lässt (Anal Biochem, 566:37-39).
Ganz zufrieden mit dem Verfahren war die Gruppe aber nicht und hat es daher weiter optimiert. Die Chinesen variierten systematisch die für das Protokoll verwendeten Lysozym-Konzentrationen (100 bis 300 mg/ml) sowie Zentrifugalbeschleunigungen (4.000 bis 13.000 g, in Tausenderschritten), um möglichst saubere pDNA mit maximaler Ausbeute zu erhalten. Die Versuche führte das Team mit drei Stämmen von Lactobacillus plantarum sowie einem Staphylococcus-aureaus-Stamm durch, für die Präparation der Plasmid-DNA verwendete es einen kommerziellen Kit für Gram-negative Bakterien. Veränderungen des osmotischen Drucks durch die Lysozym-Behandlung glichen die Forschenden durch eine fünfprozentige Glucoselösung aus, die sie als Waschlösung einsetzten.
Optimale Bedingungen
Nach der Lyse und dem Entfernen des Lysozyms bestimmte das Team die Konzentration der pDNA in Zellpellet sowie Überstand. Die besten Ergebnisse erzielte Pans Mannschaft, wenn sie den Lyse-Ansatz für eine Minute bei 7.000 g zentrifugierte, um das Lysozym zu entfernen und als Waschlösung eine fünfprozentige Glucoselösung statt einer fünfprozentigen Sucroselösung einsetzte. Die optimale Lysozym-Konzentration lag bei 200 Milligramm pro Milliliter. Mit dem verbesserten Protokoll erzielten die Chinesen mit L. plantarum pDNA-Ausbeuten von knapp 550 Nanogramm pro Mikroliter – fast neunmal mehr als mit einem kommerziellen Kit und immer noch anderthalb mal so viel wie mit dem ursprünglichen Protokoll.
Andrea Pitzschke
Zhang Y. et al. (2023): A pretreatment scheme for plasmid extraction contained sugar, high concentration lysozyme and mild lysozyme removal. Anal Biochem, 676:115242.
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