Stimmungsschwankungen gehören zum Laboralltag. Zu den Experimenten mit besonderem Begeisterungs- oder Frustationspotenzial gehören Western Blots. Trotz akribisch ermittelter Proteinkonzentrationen und vermeintlich gleicher Gesamtproteinmengen sehen die einzelnen Bahnen nach SDS-Gelelektrophorese und Blotting mitunter ziemlich uneinheitlich aus – vor allem wenn als Ladekontrollen Housekeeping-Proteine eingesetzt wurden. Die gängigsten sind beta-Aktin, beta-Tubulin sowie Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), bei pflanzlichen Proben auch Ubiquitin. Die Mengen dieser vermeintlich unabhängig von Entwicklungs- und Behandlungsbedingungen konstant exprimierten Proteine schwanken in der Zelle teils gehörig. Als Ladekontrollen sind sie daher nicht wirklich geeignet. Viele Forschende normalisieren die Proteinmenge daher, indem sie die Blotmembran in die Lösung eines Farbstoffs tauchen, der unspezifisch an Proteine bindet, beispielsweise Amido Black oder Ponceau S.
Verfälschte Messung
Die Diskrepanz zwischen normierten Proteinmengen vor dem Laden des Gels und einem ungleichen Abbild auf dem Blot lässt sich einfach erklären. Im anfangs gemessenen Gesamtproteingehalt sind in der Probe sowohl große als auch kleine Proteine beziehungsweise Peptide vorhanden. Bei der Elektrophorese schießen die kleineren jedoch über das „Ziel“ hinaus, weil sie im Gel schneller unterwegs sind. Die Bahn enthält dann weniger Gesamtprotein als ursprünglich geladen wurde. Zudem verfälschen freie Aminosäuren, die ähnlich wie Peptide als partielle Degradations- oder normale Stoffwechselprodukte vorhanden sein können, die Messung der Proteinkonzentration.
Romain Parents Team am Cancer Research Centre of Lyon suchte nach einer Lösung des Problems und entwickelte eine einfache und kostengünstige Methode für die Proteinnormalisierung von Immunoblots. Dazu verglich die Gruppe die Normalisierung mit Housekeeping-Proteinen mit der Gesamtproteinfärbung. Für die Experimente verwendete sie Leberproben von Mäusen, klinische humane Leberproben, primäre Humane Leberzellen (PHH) sowie kultivierte Nieren- (293T) und Leberzellen (LX2). Die Proteinkonzentration in der Probenflüssigkeit bestimmte Parents Mannschaft mit BCA- oder Bradford-Test, die SDS-Gele belud sie anschließend mit je 40 Mikrogramm Protein. Nach Blotting, Hybridisierung sowie Detektion der Housekeeping-Proteine mit HRP-gekoppelten Sekundärantikörpern tauchten die Forschenden die Membranen für eine Minute in eine Färbelösung aus 0,1 % Ponceau S in 5% Essigsäure und wuschen sie danach fünfmal in destilliertem Wasser.
Kein Verlass auf Housekeeping-Proteine
Die Ergebnisse waren ziemlich ernüchternd. Die relativen Signalintensitäten der Housekeeping-Proteine waren völlig uneinheitlich und korrelierten auch nicht mit den Intensitäten der Ponceau-S-Färbung. Die Gruppe kommt daher zu dem Schluss, dass man sich bei der Normalisierung nicht auf Housekeeping-Proteine verlassen sollte.
Die Intensität der Ponceau-S-gefärbten Bahnen war hingegen annähernd gleich und spiegelte ungefähr einheitliche Lademengen wider. Zudem lässt sich mit der Gesamtproteinfärbung der Abbau von Proteinen anhand verschmierter Bahnen besser einschätzen. Die Schwachstelle der Ponceau-S-Färbung ist die Übersättigung. Einzelne, besonders stark in der Probe vertretene Proteine erzeugen sehr starke Banden, deren Farbsignal nicht mehr proportional zum Proteingehalt ist. Pflanzenforscher und -forscherinnen kennen das von RuBisCo. Wer hier einfach weniger Gesamtprotein lädt, riskiert, dass sein eigentlich aufzuspürendes Protein unter die Detektionsgrenze rutscht.
Die Franzosen lösen dieses Problem, indem sie Ponceau S nicht via rotem Farbsignal, sondern anhand seiner Fluoreszenz detektieren. Der Azofarbstoff hat aromatische Gruppen, die durch 488-Nanometer-Licht angeregt werden und daraufhin bei einer Wellenlänge von 520 Nanometern fluoreszieren. Das Fluoreszenzsignal ist proportional zur Anzahl der gebundenen Ponceau-S-Moleküle, die Sättigung des Signals lässt sich mit kürzeren Expositionszeiten verhindern.
Sensitiver als StainFree
Maß das Team die Gesamtproteinmengen auf den Blots anhand der Fluoreszenz von Ponceau S, stimmten diese sehr gut mit den tatsächlich geladenen Probenmengen überein. Bei Verdünnungsreihen beobachteten die Forschenden über die gesamte getestete Konzentrationsspanne von 0,6 bis 100 Mikrogramm einen linearen Zusammenhang zwischen den Fluoreszenzsignalen der mit Ponceau S gefärbten Bahnen und den ursprünglich geladenen Proteinmengen. Zudem war die Ponceau-S-Fluoreszenz-Methode sensitiver als kommerzielle Fluoreszenz-basierte Normalisierungstechniken wie zum Beispiel StainFree.
Ponceau S geht mit Proteinen keine kovalenten Verbindungen ein, sondern interagiert nur elektrostatisch mit positiv geladenen Aminogruppen. Da sich diese nicht auf eine Aminosäure beschränken, wird die Ponceau-S-Färbung auch nicht durch die Proteinsequenz verzerrt – im Gegensatz zur StainFree-Technik, bei der der Farbstoff kovalent an Lysin- und Tryptophanreste der Proteine bindet.
Andrea Pitzschke
Verzeroli C. et al. (2023): A fluorescent Ponceau S-based total protein normalization method for conventional and challenging immunoblot samples. Anal Biochem, 681:115330.
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