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(09.11.2022) Mit genetischen Schaltkreisen und logischen Gattern programmieren Forscher Zellprozesse nach ihren Wünschen. Ein Ziel, das sie damit erreichen wollen, sind theranostische Systeme, die Diagnose und Therapie verbinden.

Jede biologische Zelle ist zugleich eine hochkomplexe Recheneinheit: Permanent erhält sie Input von außen, etwa durch chemische, mechanische, elektrische oder optische Signale. Und jedes Mal muss die Zelle entscheiden, ob und wie sie darauf reagiert. Während einer Entzündung zum Beispiel ist die Erregungsschwelle eines Nozizeptors viel niedriger eingestellt als im gesunden Gewebe – wir sind schmerzempfindlicher. Die Reaktion einer Zelle ist also auch vom Kontext abhängig. Ähnlich wie ein Computer, der ein Programm umsetzt, trifft auch die Zelle „Wenn-dann“-Entscheidungen. „Wenn der Ligand den Rezeptor verformt, dann schicke folgenden Transkriptionsfaktor in den Zellkern.“ Auf die kleinsten Bausteine reduziert ist es natürlich die Chemie, die in der Zelle entscheidet; während auf einem Computerchip der elektrische Strom bestimmt, ob eine Wenn-dann-Bedingung erfüllt ist oder nicht.

Auch komplexe Computerprogramme lassen sich letztendlich aus einigen wenigen sogenannten Logik-Gattern zusammenbasteln, wenn man ausreichend viele sinnvoll kombiniert. Eine biologische Zelle ist zwar kein digitaler Computer, konzeptionell lohnt aber ein kurzer Ausflug in die Silicium-Welt – gerade weil dort alles sehr klar definiert und binär auf null und eins reduzierbar ist. „Wenn Bedingung x erfüllt ist, dann...“ Diese Abfrage lässt zwei Möglichkeiten zu: Ja oder nein. In der sogenannten Booleschen Logik (benannt nach dem Mathematiker George Boole) sprechen Informatiker von wahr oder falsch und schreiben für wahr eine 1 und für falsch eine 0. In der elektronischen Schaltung steht 1 für Stromfluss, 0 für keinen Stromfluss.

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Ein einfacher elektronischer Schaltkreis verrechnet mindestens einen Eingang (Input), zu einem Ausgangssignal (Output). Das lässt sich mit Logik-Gattern umsetzen und auch sprachlich anschaulich darstellen. Ein Beispiel ist die Verneinung: Kommt eine 1 herein, gibt die Schaltung eine 0 heraus – und umgekehrt. In der Sprache der Booleschen Algebra ist dies ein sogenanntes Nicht-Gatter oder NOT-Gate.

Wie realisiert eine biologische Zelle ein NOT-Gate? Eine Protein-codierende Sequenz könnte hinter einem konstitutiven Promotor liegen, also dauerhaft abgelesen und translatiert sein. Aber ein ganz bestimmtes Signal von außen mobilisiert einen Repressor, der dann in den Zellkern wandert und den Promotor blockiert. Das Signal könnte die Aminosäure Tryptophan sein. Sie bindet an einen Repressor und aktiviert ihn. Der Repressor blockiert daraufhin zum Beispiel bei Bakterien ein Gen für die Tryptophan-Synthese. Das ergibt Sinn, denn offensichtlich ist in der Zelle ja bereits Tryptophan vorhanden. Fehlt die Aminosäure, kann auch der Repressor nicht mehr binden – das Bakterium stellt sein Tryptophan wieder selbst her. Diese Operons sind klassische Beispiele dafür, wie sich eine Zelle reguliert und dabei Entscheidungen trifft, die man auch mittels Boolescher Logik abstrahiert darstellen kann. Molekularbiologen bedienen sich aus dem Operon-Werkzeugkasten und integrieren sie in genetische Schaltkreise, die der Booleschen Logik gehorchen. Kontrolliert man etwa das Gen, das für das grün fluoreszierende Protein (GFP) codiert, mit einem entsprechenden Promotor, leuchtet die Zelle immer dann grün, wenn das Input-Signal nicht vorhanden ist, wenn also Tryptophan fehlt. Aus 0 (kein Tryptophan) wird 1 (grüne Fluoreszenz).

Bei Wenn-dann-Abfragen innerhalb eines Computerprogramms prüft man aber oft mehrere Bedingungen gleichzeitig: „Falls es wärmer ist als 25 Grad Celsius und das Freibad geöffnet hat, laufe ich zum Schwimmbad.“ Nur wenn beide Aussagen wahr sind (also beide Inputs auf 1 stehen), mache ich mich auf den Weg (Output 1). Steht aber auch nur einer der beiden Inputs auf 0, soll auch der Output 0 sein – ich möchte nämlich weder frieren noch vor verschlossenem Eingangstor stehen.

Auch dieses Und-Gatter (AND-Gate) ist als elektronischer Schaltkreis leicht realisierbar, doch wir interessieren uns ja für die Zelle. Bleiben wir bei GFP und einem grünen Leuchten als Output, das wir als 1 interpretieren wollen. Ein genetisches AND-Gate kann man durch zwei Repressoren realisieren, die auf jeweils ein anderes Input-Signal reagieren; in diesem Fall aber soll das Input-Signal einen Repressor vom Promotor lösen und die Genexpression freigeben. Erst wenn beide Repressoren entfernt sind (also beide Inputs auf 1 stehen), wird GFP abgelesen.

Sie ahnen es, wir können auch ein Oder-Gatter, also ein OR-Gate genetisch lösen: Hierzu platzieren wir GFP hinter einen regulatorischen Abschnitt, der von zwei verschiedenen Transkriptionsfaktoren aktiviert werden kann – es genügt, wenn einer der beiden bindet. Beim Googeln werden Sie noch weitere Logik-Gatter finden, durch das Verschalten mehrerer Logik-Gatter lassen sich auch kompliziertere Abfragen mit mehreren Inputs und Outputs umsetzen. Informatiker legen hierfür meist sogenannte Wahrheitstabellen an, mit allen Input-Kombinationen auf der einen und den zugehörigen Outputs auf der anderen Seite. Für die entsprechenden elektronischen Schaltkreise gibt es Symbole, die auch die synthetische Biologie für die Modellierung und Darstellung genetischer Schaltkreise verwendet.

Da grün fluoreszierendes GFP und rot leuchtendes mCherry Farbe in die Sache bringen, als letztes Beispiel noch ein genetischer Schalter. Stellen wir uns vor, ein Bakterium ist mit GFP und mCherry ausgestattet. GFP wird immer gemeinsam mit einem Repressor exprimiert, der dann mCherry blockiert. Andererseits wird gemeinsam mit mCherry immer ein Repressor hergestellt, der die GFP-Synthese unterbindet. Es kann also immer nur eines der beiden Fluoreszenzproteine synthetisiert werden: Die Zelle leuchtet entweder grün oder rot.

Gibt man eine Substanz A in die Bakterienkultur, die den Repressor vor GFP entfernt, oder eine Substanz B, die den Repressor von mCherry inaktiviert, so können wir zwischen grün und rot hin und her schalten – und in diesem Beispiel sogar eine gleichzeitig grüne und rote Bakterienkultur induzieren, indem wir zugleich Substanz A und B zugeben und beide Repressormoleküle inaktivieren.

Mit einem derartigen Schalter können Zellen Information speichern. Lässt man die grüne Bakterienkultur übers Wochenende im Labor zurück, bleibt sie grün. Es sei denn, jemand gibt Substanz B zu. Auf diese Weise könnte jemand aus dem Labor eine Ja-oder-Nein-Botschaft verschicken, die man nach der Rückkehr ins Labor auslesen kann, indem man schaut, ob die Bakterien rot geworden oder grün geblieben sind.

Timothy Lu vom Massachusetts Institute of Technology in Cambridge, USA, beschäftigt sich seit vielen Jahren mit genetischen Schaltkreisen. 2013 hatte er zusammen mit Piro Siuti und John Yazbek ein Konzept vorgestellt, wie man Information genetisch abspeichern kann. In ihrer Arbeit verwendet die Gruppe ebenfalls GFP als Signalgeber für den Output. Vor der GFP-codierenden Sequenz liegen zwei Terminator-Sequenzen, die die GFP-Synthese verhindern. Beide Terminator-Abschnitte sind aber jeweils von einer Erkennungssequenz für eine Rekombinase flankiert. Die Rekombinase dreht die Terminatoren um, sodass sie ihre Funktion verlieren. Nur wenn beide Rekombinasen aktiv sind, werden die Terminatoren deaktiviert – und nur dann ist GFP aktiv. Dieses AND-Gate speichert also zugleich einen Zustand stabil im Genom ab (Nat. Biotechnol. 31(5): 448-52).

Programmierbare Zellen beflügeln auch die Fantasie von Forschern, die Therapien gegen Krankheiten entwickeln. Dieses Ziel verfolgt zum Beispiel Martin Fusseneggers Gruppe am Department für Biosysteme der ETH Zürich in Basel. In einem gemeinsam mit Maysam Mansouri verfassten Review greift Fussenegger die Idee auf, die sich hinter dem Begriff Theranostik verbirgt, einem Kunstwort aus Therapie und Diagnostik (Protein Cell 13(7): 476-89).

„Es gibt eine ganze Reihe von Krankheiten, die Sie nicht von heute auf morgen bekommen, sondern die sich erst über Jahre entwickeln“, erklärt Fussenegger hierzu. Beispiele sind Alzheimer, verschiedene Krebserkrankungen oder Typ-2-Diabetes. „Da wüsste ich eigentlich gern jetzt schon, ob etwas schiefläuft, damit ich noch etwas dagegen tun kann.“

Zumindest im Gedankenexperiment bieten genetische Schaltkreise endlos viele Möglichkeiten für die Theranostik. Man könnte zum Beispiel diagnostische Bakterien verwenden, die auf bestimmte Biomarker reagieren und dann ein Signal abgeben – oder wie Timothy Lus Rekombinasen sogar ein genomisches Protokoll niederschreiben.

Vielleicht wird auch eine andere Idee der Theranostik irgendwann Teil einer Standard-Vorsorgeuntersuchung: Der Patient nimmt ein harmloses Darmbakterium mit „diagnostischen Schaltkreisen“ ein, und anschließend analysiert man im Stuhl das Genom dieser Bakterien. Für etliche Krankheits-assoziierte Biomarker hätte man eigene Reporter-Abschnitte im Genom, die entweder umgedreht worden sind oder nicht. Man könnte auch quantitativ auswerten, wie hoch der Anteil der DNA mit einem „Vermerk“ im Genom ist und so auf die Konzentration eines Biomarkers schließen.

Fussenegger denkt aber bereits einen Schritt weiter: Was wäre, wenn man körpereigene Zellen so programmiert, dass sie nicht nur diagnostizieren, sondern auch intervenieren? Bei Risikopatienten könnten theranostische Zellen vielleicht einmal einen Herzinfarkt verhindern, weil sie auf physiologische Marker im Blut schnell reagieren, aber inaktiv bleiben, solange alle Parameter unauffällig sind.

In ihrem Review diskutieren Mansouri und Fussenegger verschiedene Arten von Zellen, die man modifizieren könnte: Körpereigene primäre Zellen wären nicht immunogen, hätten aber nur eine begrenzte Lebensdauer. Am einfachsten ließe sich mit immortalisierten Zelllinien arbeiten, die aber das Immunsystem des Empfängers aktivieren. Würde man patienteneigene Stammzellen editieren, so bliebe das Risiko, dass sich diese unkontrolliert reproduzieren.

Mit der CAR-T-Zell-Therapie existiert bereits ein zugelassenes Verfahren, bei dem man dem Patienten Zellen entnimmt, diese genetisch modifiziert und danach wieder verabreicht. CAR steht für chimärer Antigenrezeptor, einige Leukämieformen lassen sich damit bereits erfolgreich behandeln. T-Lymphozyten des Patienten werden genetisch mit einem Antigen-bindenden Rezeptor ausgestattet, dessen variabler synthetischer Teil genau zu einem tumorspezifischen Protein passt. Die Rezeptoren der T-Zellen muss man also individuell auf die Krebszellen eines einzelnen Patienten zuschneiden.

Diese T-Zellen können spezifisch an die Krebszellen binden. Wenn das geschieht, wird die T-Zelle aktiv und induziert über ihre zytotoxischen Signale die Zerstörung der Krebszelle. Bislang gibt es aber noch keinen Weg, die T-Zellen gezielt nach Krebszellen suchen zu lassen; damit ließen sich auch solide Tumore und deren Metastasen adressieren. Mit AND-Gates könnte man die mit dieser Strategie verbundenen Risiken verringern, indem man mehrere Bedingungen festlegt, die für die Aktivierung erfüllt sein müssen. Gegen Mutationen der Krebszellen wiederum wären OR-Gates hilfreich, die verschiedene Antigene berücksichtigen.

Aber auch die (zumindest konzeptionell) simple CAR-T-Zell-Therapie unterscheidet sich von der schlichten Gabe eines Wirkstoffs: Die T-Zellen erwachen nur, wenn sie auf eine Tumorzelle treffen. Sind alle Krebszellen beseitigt, sind die T-Zellen wieder inaktiv.

Besonderes Potenzial für programmierbare Zellen sieht Fussenegger beim Diabetes. Am Tiermodell setzt seine Gruppe bereits Zellen ein, die den Blutzucker automatisch regulieren. „Diabetes ist in mehrfacher Hinsicht ein Parade-Modellsystem: Im Westen sind zehn Prozent der Bevölkerung betroffen, Tendenz steigend. Die Kosten sind horrend, weil man ein Leben lang therapiert werden muss.“ Zugleich aber sei es recht simpel, den Blutzucker zu regulieren. „Dafür brauchen Sie nur zwei Gene“, so Fussenegger. Die Zelle muss einerseits in der Lage sein, den Glucosespiegel zu messen, zum anderen muss sie ab einer kritischen Konzentration Insulin ausschütten.

„Momentan führen wir unsere Experimente an der Maus durch“, erklärt der Schweizer. „Wir implantieren menschliche Zellen mit menschlichen Netzwerken, um die Dynamik zu testen, und die werden von der Maus natürlich abgestoßen. Deshalb verkapseln wir sie in einer Art Teebeutel.“ Durch die Grenzfläche der Beutel können Stoffe diffundieren, für das Immunsystem der Maus bleiben die fremden Zellen aber unsichtbar. Bei der Maus sind die Zellen meist im Bauchraum implantiert. Die Baseler erproben, meist in Kooperation mit anderen Teams, verschiedene zusätzliche Genschalter – zum Beispiel die Insulin-Freigabe nach einem elektrischen Signal oder, für Kaffeetrinker interessant, induziert durch Coffein (Science 368(6494): 993-1001; Nat. Commun. 9(1): 2318).

Auf den ersten Blick scheint der Weg der Theranostik bis zur erfolgreichen Therapie von Krankheiten noch lang, doch eine mögliche Anwendung könnte schon zum Greifen nahe sein. „Seit der Pandemie haben wir die Möglichkeit, RNA effizient in Muskelgewebe einzubringen – und man muss nur wenige somatische Zellen dazu bringen, den Blutzucker zu messen und bei Bedarf Insulin zu sekretieren.“ Die Funktion der Inselzellen aus der Bauchspeicheldrüse würden hierdurch andere Körperzellen übernehmen. Dass mRNA mit der Zeit abgebaut wird, sieht Fussenegger nicht als großes Problem. „Die Muskelzellen teilen sich ja nicht, und dann kann sich RNA schon einige Zeit halten“, erklärt er. Es wäre eine elegante Methode und würde das ständige Messen des Blutzuckerspiegels durch den Patienten überflüssig machen. „Wenn Sie Diabetiker fragen, ob sie anstatt täglich zu spritzen sich einfach einmal im Monat RNA injizieren, dann würden die meisten das Angebot sicher sofort annehmen.“

Fussenegger spricht sogar von einer Heilung, denn die Funktion ist wiederhergestellt und läuft ganz von selbst als biologischer Regelkreis. Frühzeitig eingesetzt dürfte man damit auch die Folgeerkrankungen von Diabetes verhindern.

Auch konzeptionell entwickeln Fussenegger und seine Kollegen und Kolleginnen genetische Schaltkreise weiter. „Wir haben einen Full Adder entwickelt, also ein System aus mehreren Zellen, das die Grundrechenarten beherrscht und damit eigentlich schon eine enorme Komplexität erlaubt“, berichtet Fussenegger und verweist auf eine Veröffentlichung aus dem Jahr 2018 (Nat. Methods 15(1): 57-60). Seine Gruppe wolle biologische Systeme auch den Computerwissenschaftlern schmackhaft machen. Fussenegger hierzu: „In einem Computer hat man vielleicht sechs oder acht Cores, und jeder Core rechnet mit einer unglaublichen Frequenz von vielen Gigahertz sequenziell Nullen und Einsen durch. Aber ein Organismus besteht aus Milliarden Zellen, also habe ich prinzipiell auch Milliarden Cores zur Verfügung.“Man brauche keine Sicherheitsupdates, und biologische Systeme hätten zudem die Fähigkeit, sich selbst zu reparieren. Das alles hat Vor- und Nachteile. Herausforderungen bestehen darin, dass viele Promotoren durchlässig (leaky) sind. Da man sie nicht komplett abschalten kann, lässt sich der Zustand null oder eins nur über analoge Schwellen realisieren. Aber auch diese können schwanken, weil eine Zelle neben der Berechnung auch noch ihre eigenen Stoffwechselwege am Laufen halten und auf komplexe Umgebungsreize reagieren muss. Kurz gesagt: Auch mit Repressor vor dem GFP wird man meist noch ein schwaches grünes Hintergrundleuchten messen.

Während sich elektronische Schaltkreise mit identischen Bauteilen fast beliebig verschalten lassen, muss jeder einzelne genetische Schaltkreis auch chemisch eindeutig sein. Ein Transkriptionsfaktor, der nur GFP aktiviert, kann also nicht in derselben Zelle für einen mCherry-Reporter benutzt werden. Die Community der synthetischen Biologie arbeitet daher mit Hochdruck daran, „dichte“ genetische Schaltkreise mit vorhersagbaren Eigenschaften zu entwickeln, die auch miteinander kombinierbar sind. Dieser Baukasten wächst beständig und die CAR-T-Zell-Therapie ist ein erstes Beispiel dafür, dass man Zellen tatsächlich für therapeutische Zwecke umprogrammieren kann. Es muss also nicht immer nur bei einem „Ausblick in die ferne Zukunft“ für Projektantrag und Pressemitteilung bleiben.