DNA bei gleichbleibender Temperatur amplifizieren, ganz ohne teure Thermocycler – das ist möglich mit der Loop-mediated Isothermal Amplification, kurz: LAMP. Während der Amplifikation entsteht einzelsträngige DNA, die hantelförmige Sekundärstrukturen bildet und an den Schleifen oder Loops für die Primer leicht zugänglich ist. Eine spezielle Strand-displacement-Polymerase verlängert gebundene Primer und schiebt doppelsträngige Stücke außerhalb der Schleifen einfach beiseite. Aktuelles zur LAMP haben wir in unserem Methoden-Special zur isothermalen Amplifikation zusammengefasst.
Interessant ist die LAMP unter anderem für diagnostische Zwecke, um Erreger in einer Probe nachzuweisen. In diesem Fall will man auch ein Signal sehen, idealerweise per Fluoreszenz. Die Intensität des Signals sollte auch abbilden, wie viel Material in der Ausgangsprobe vorhanden war, sodass man quantitativ messen kann. Die Chemikerin Lisa Becherer hat mit der „Mediator Displacement LAMP“ oder MD LAMP im Rahmen ihrer Doktorarbeit solch eine Methode entwickelt. Während ihrer Promotion war Becherer in Freiburg tätig, zunächst am Institut für Mikrosystemtechnik (IMTEK) und später bei der Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung. Inzwischen ist sie Prozessingenieurin bei der Sick AG in Waldkirch.
Schon in den Nullerjahren gab es die LAMP (Nucleic Acids Res, 28(12): E63), doch bis heute ist für die meisten von uns „PCR“ das Synonym für den Sequenz-spezifischen Nukleinsäure-Nachweis.
Lisa Becherer: Es hat tatsächlich bis 2012 gedauert, bis Tanner und Co. in einer Publikation die Detektion mit Fluoreszenz-basierten Sonden für die LAMP vorgestellt haben, mit denen man mehrere Targets gleichzeitig nachweisen konnte (Biotechniques, 53(2): 81-9). Das hat dann auch sehr gut funktioniert und wurde viel eingesetzt. Allerdings gab es die PCR schon sehr viel früher, und so gab es auch mehr Zeit, dafür Detektionsmethoden weiterzuentwickeln. Der Vorteil der LAMP lag darin, dass die Geräte einfach und günstig waren. Da hatte sich zunächst die Trübungsmessung bewährt und wurde auch viele Jahre genutzt.
Diese Trübung in der LAMP war ein indirektes Signal. Man konnte zwar über die Absorption grob auf die Konzentration eines Targets in der Probe rückschließen, aber brauchbar war sie trotzdem nur als ein „Ja-oder-Nein“-Ergebnis. Mit dem Vorteil, dass man dieses Ergebnis auch mit bloßem Auge ablesen konnte.
Becherer: Genau. Die Trübung kommt dadurch zustande, dass Magnesiumpyrophosphat dann ausfällt, wenn DNA amplifiziert wird. Aber das kann natürlich auch ein Nebenprodukt sein, wenn ein Primer falsch gebunden hat. Und bei der LAMP haben wir mindestens vier Primer pro Target, die auch nicht gerade kurz sind. Falls es dann mal zu einer Nebenreaktion kommt, ist die Trübungsmessung nicht sehr spezifisch. Ein zweiter Nachteil: Man kann nicht multiplexen, weil man bei einer Trübung nicht unterscheiden kann, welches Target amplifiziert wird. Daher muss man die Reaktionen aufsplitten. Verteilt man eine Probe aber auf verschiedene Gefäße, dann gibt es für jede einzelne Messung auch weniger Ausgangsmaterial. Daher kam dann auch ein Bedarf für das Multiplexen auf.
Sodass man in ein und demselben Reaktionsvolumen unterschiedliche Targets spezifisch nachweisen kann – und für jede Zielsequenz eine andere Farbe aufleuchtet, falls sie vorhanden ist. Oder man will vielleicht ein Kontroll-Target zusätzlich in der Probe haben, um sich zu vergewissern, dass eine Amplifikation auch stattfinden kann und nicht irgendwie inhibiert wird. Auch die Sonde für die Kontrolle braucht dann ja eine eigene Farbe. Im Rahmen Ihrer Doktorarbeit haben Sie solch eine Multiplexing-fähige Detektionsmethode entwickelt. Was war die Motivation dahinter?
Becherer: Wir wollten die LAMP für die Point-of-Care-Diagnostik verwenden: Günstige Geräte, die man direkt vor Ort einsetzen kann. Das Ganze in Kombination mit mikrofluidischen Testträgern, auf denen Probenvorbereitung und Amplifikation automatisiert in einer Kartusche stattfinden. Wegen des limitierten Platzes auf der Kartusche und der begrenzten Probenmenge war es notwendig, mehrere Zielmoleküle in einer Reaktion nachzuweisen. Unser Ziel war also, so viele Erreger wie möglich detektieren zu können – zum Beispiel verschiedene HIV-Subtypen damals in meinem Projekt (Anal Chem, 90(7): 4741-4748).
Es gab bereits Methoden zur Sequenz-spezifischen Detektion, aber das Design der Sonden war sehr aufwendig. Stellen Sie sich vor, Sie wollen in einem Assay drei Zielmoleküle nachweisen. Dann brauchen Sie drei Sonden, die Sie optimieren müssen. Wir haben stattdessen unsere Detektionsmethode nur einmal designt und für die maximale Fluoreszenz-Ausbeute optimiert. Dieselbe Methode können wir für den Nachweis unterschiedlicher Erreger einsetzen.
Bei den anderen Methoden musste man die Sonden also für jedes Target designen und gewissermaßen das Rad neu erfinden?
Becherer: Richtig. Denn klassischerweise befindet sich das Fluorophor zusammen mit einem Quencher direkt am Primer.
Der Quencher ist ein molekularer Baustein, der die Fluoreszenz zunächst unterdrückt.
Becherer: Genau – entweder wird der Quencher beim Binden des Primers verdrängt, weil sich die Sonde verformt, oder er wird abgespalten. Dann kann das Fluorophor zum Leuchten angeregt werden. Hier liegt nun aber das Problem, denn die Zielsequenz bestimmt, welche komplementären Basen am Reporter angebracht sein müssen. Zum Beispiel können zu viele Guanin-Basen Fluoreszenz-Signale unterdrücken. Dann müssen Sie sich eine andere Stelle im Zielmolekül suchen. Man muss Bindungsenthalpien anschauen und überprüfen, wie Fluorophore zueinander ausgerichtet sind, damit sich Signale nicht auslöschen. Solche Sonden zu designen, ist daher sehr aufwendig. Und da war meine Motivation, nur einmal ein System mit einem universellen Reporter zu entwickeln, der nicht von der Zielsequenz abhängt.
Der Reporter, der die eigentliche Fluoreszenz erzeugt, wird später zugegeben und ist völlig unabhängig von der Sequenz der Primer. Stattdessen gibt es an einem Primer einen Vermittler oder Mediator, der sich beim Binden des Primers ablöst; Primer und Mediator bilden dann die Sonde. Hier muss man aber auch für jedes neue Ziel wieder eine neue Sonde basteln.
Becherer: Klar. Das ist aber eben die einzige notwendige Adaption. Sie können auch eine bereits validierte LAMP benutzen und einfach an einen der Loop-Primer am 5’-Ende verlängern mit einer zum Mediator komplementären Sequenz. Der Mediator, der an diesen Primer hybridisiert, ist nicht modifiziert. Das ist wirklich nur ein Oligonukleotid, das Sie nicht verändern müssen. Wenn der Primer während der LAMP ans Target bindet, dann wird der Mediator von der Polymerase verdrängt.
Jetzt kann der freischwimmende Mediator also an den universellen Reporter binden. Das Fluorophor des Reporters ist an einem Oligonukleotid befestigt, das auch einen Quencher enthält. Durch die Sekundärstruktur blockiert der Quencher die Fluoreszenz.
Becherer: Ja. Und dann bindet der Mediator an den universellen Reporter und gibt das Fluoreszenz-Signal frei. Dadurch haben wir die Generierung des Fluoreszenz-Signals von der Amplifikation des Zielmoleküls räumlich entkoppelt. Das Signal wird also nicht durch mein Zielmolekül beeinflusst. Das Signal-Rausch-Verhältnis bleibt immer gleich.
Und mit diesen Sonden können Sie auch multiplexen, indem Sie verschiedene Paare von Mediatoren und Reportern in derselben Probe verwenden, richtig?
Becherer: Genau. Also angenommen, Sie möchten eine Probe auf drei verschiedene Erreger testen. Dann geben sie diese drei Mediatoren zum Primer-Mix. Und diese drei verschiedenen Mediatoren können jeweils einen bestimmten universellen Reporter aktivieren. Jedes Reporter-Molekül wiederum fluoresziert mit einer anderen Farbe. Sagen wir, Target 1 und Target 2 sind vorhanden. Dann binden Primer 1 und Primer 2 und setzen jeweils ihren Mediator frei. Mediator 1 bindet an Reporter 1 und Mediator 2 an Reporter 2. Diese beiden Farben leuchten dann – nicht aber die Farbe für Target 3.
Auf wie viele verschiedene Zielsequenzen kann man denn in ein und derselben Probe testen?
Becherer: Da kommt es natürlich auf die Detektionstechnik an. Wir haben mit einem Rotor-Gene von Qiagen gearbeitet. Die können bis zu sechs Farben unterscheiden. Trotzdem hat man aber einen gewissen Crosstalk, sodass zum Beispiel ein oranges Signal auch in den roten Kanal durchscheinen kann. Das hängt also auch vom Gerät ab.
Dann gibt es aber auch eine Limitierung bei der LAMP selber. Wenn ich fünf verschiedene Erreger in einer Probe habe, auf die ich testen will, dann müssen deren Zielsequenzen ja alle gleichzeitig amplifiziert werden. Im Gegensatz zur PCR haben Sie bei der LAMP keine diskreten kontrollierten Zyklen, sondern alles findet gleichzeitig statt. Ist nun die eine Reaktion sehr schnell und verbraucht die Komponenten im Mix, so kann es sein, dass ein anderes Target zu langsam ist und einfach nicht hinterherkommt, um ein Signal zu erzeugen. Hier muss man also auch die Primer-Effizienz sorgfältig ausbalancieren. Mit drei Targets funktioniert das in der Regel sehr gut.
Das Gespräch führte Mario Rembold
Bild: Analytical Methods
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